從pre-mRNA中去除內含子是由被稱為剪接體的大型動態RNA蛋白復合物催化的，該復合物被教科書上稱之為細胞里最復雜的超大分子復合物，它是由5個小核糖核蛋白顆粒(snRNPs)和幾十個蛋白質因子在每個pre-mRNA底物上從頭組裝而成的。在剪接反應過程中，多種蛋白-核酸復合物及剪接因子按照高度精確的順序發生結合、重排和解聚，依次形成預組裝復合物U4/U6.U5 Tri-snRNP(U4/U6.U5三小核核糖核蛋白復合物)以及至少8個狀態的完全組裝剪接體pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS復合物。其中內含子分支位點(Branch Site，BS)識別是剪接體組裝過程中的關鍵事件。在哺乳動物中，內含子分支位點序列的保守性較差，理論上，僅通過堿基配對機制無法實現精確的內含識別。因此解析出該事件發生時的剪切體形態結構對解決此問題就顯得極為重要。
RNA剪接示意圖【1】
2021年11月25日，海德爾堡大學的Wojciech P. Galej教授團隊在Science上發表了題為Structural basis of branch site recognition by the human spliceosome的文章，在該研究中作者分離了人類17S U2 snRNP，并在體外重構了其依賴于ATP的重塑和與pre-mRNA 底物的結合，從而確定了一系列不同構象狀態 U2 snRNP的冷凍電鏡結構，包括兩個以前未知的組裝中間體。這些高分辨率重建提供了對人類U2 snRNP和前剪接體形成的結構和動力學新視角。這些新數據指出HTATSF1和SF3B6在促進pre-mRNA識別方面的關鍵作用。
為了純化得到特別代表單一功能狀態的U2 snRNP子集，作者使用CRISPR-Cas9介導的基因組編輯將GFP標簽引入HEK293F細胞的HTATSF1基因組位點，使用抗GFP的納米抗體來分離完整的17S U2 snRNP，其中包含U2 snRNA和22種蛋白質，總估計分子量為1.08 MDa。提高分辨率到2.2 Å后，作者發現這些結構與之前的低分辨率結構是一致的。
為了通過冷凍電鏡分析獲得對BS識別的機制，作者用純化的17S U2 snRNP和模型BS寡核苷酸(BPS寡核苷酸)在體外重建了BS識別。BPS寡核苷酸與U2 snRNA的27-42位互補，并包括一個凸出的腺苷，用以模擬BP-A。作者通過HTATSF1或DDX46上的GFP標簽將17S U2 snRNP固定在抗GFP納米抗體樹脂上，并在各種條件下孵育。在存在ATP和BPS oligo的情況下，U2 snRNP從樹脂中釋放并在通過甘油梯度離心分析時也能保持與BPS oligo的結合。在沒有BPS寡核苷酸的情況下，單獨添加ATP也會在升高的溫度下誘導HTATSF1解離，這表明這種重構可以在功能上與底物結合分離，從而導致形成重構U2 snRNP。
后續的工作作者解析了這兩個新發現的U2 snRNP復合物的高分辨率冷凍電鏡結構。
接下來，作者解析了A樣U2 snRNP的整體結構。盡管A樣U2 snRNP先前的U2 snRNP的低分辨率描述非常一致，但是仍然有跟之前不一致的結構，表明A樣U2 snRNP代表了一個不同的剪接中間體。改造后的U2 snRNP與A樣U2 snRNP非常相似，除了U2 snRNA 5'端的主要差異以及缺少SF3B6。與17S U2 snRNP類似，這兩種復合物都可以分為5'-結構域和3'-結構域，都可以很好地獲得結構信息。
在這項工作中，17S U2 snRNP的結構表明HTATSF1和BSL以兩種不同的方式相互穩定。BSL和HTATSF1LH/UHM之間可以直接發生相互作用，也可以間接通過U2 snRNA的5'-末端與HTATSF1RRM的可能關聯，阻止與BSL競爭的RNA結構的形成。本文的數據表明，模型BPS寡核苷酸可以與U2 snRNP進行堿基配對相互作用。A樣U2 snRNP的結構捕獲了與分支螺旋相互作用的SF3B6，這提供了兩個重要信息。首先，除了SLIIa和SF3A2ZnF之外，它還為U2 snRNA提供了一個特定的結合位點，這使得分支螺旋結合口袋內的U2 snRNA具備了螺旋幾何形狀。這提供了在缺乏廣泛的互補性的情況下一種穩定弱分支點序列的機制。其次，SF3B6在分支螺旋雙鏈體和U2 snRNA的單鏈區域的連接處結合，因此它定義了分支螺旋的長度和凸起的BP-A相對于其末端的確切位置。經過與BMSL競爭的BS序列將繼續通過最近提出的腳趾固定鏈侵入機制(toe-hold strand invasion mechanism)逐漸形成分支螺旋。該過程中的中間狀態(A3'-SSA 復合物)是通過用剪接抑制素A(SSA)阻斷剪接體組裝而捕獲的，在沒有SSA抑制的情況下，BS序列將繼續完全形成分支螺旋。此時將到達另一個檢查點：如果存在凸出的BP-A，它將結合SF3B1中的口袋，這將導致DDX46轉變為半封閉構象并解;然而，在沒有正確定位的BP-A的情況下，SF3B1HEAT保持開放構象，剪接體停滯。在該復合物中，Prp5為剪接體組裝的下一步提供位阻，即募集tri-snRNP。Prp5的長時間阻塞可能會啟動丟棄途徑。
在這項工作中描述的改造形式的U2 snRNP和pre-A復合物是兩種不同的中間體，它們將次優底物引導至丟棄途徑。它們代表BS保真度控制中的不同檢查點，確保穩定分支螺旋的形成和正確定位的BP-A的存在。
總之，這項工作確定了一系列高分辨率(2.0-2.2 Å)結構，提供了分支位點選擇過程的快照。與底物結合的U2 snRNP表明SF3B6穩定了BS:U2 snRNA復合體，這有助于結合序列互補性較差的內含子。
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