從pre-mRNA中去除內(nèi)含子是由被稱為剪接體的大型動(dòng)態(tài)RNA蛋白復(fù)合物催化的，該復(fù)合物被教科書上稱之為細(xì)胞里最復(fù)雜的超大分子復(fù)合物，它是由5個(gè)小核糖核蛋白顆粒(snRNPs)和幾十個(gè)蛋白質(zhì)因子在每個(gè)pre-mRNA底物上從頭組裝而成的。在剪接反應(yīng)過程中，多種蛋白-核酸復(fù)合物及剪接因子按照高度精確的順序發(fā)生結(jié)合、重排和解聚，依次形成預(yù)組裝復(fù)合物U4/U6.U5 Tri-snRNP(U4/U6.U5三小核核糖核蛋白復(fù)合物)以及至少8個(gè)狀態(tài)的完全組裝剪接體pre-B、B、Bact、B*、C、C*、P以及ILS復(fù)合物。其中內(nèi)含子分支位點(diǎn)(Branch Site，BS)識(shí)別是剪接體組裝過程中的關(guān)鍵事件。在哺乳動(dòng)物中，內(nèi)含子分支位點(diǎn)序列的保守性較差，理論上，僅通過堿基配對(duì)機(jī)制無法實(shí)現(xiàn)精確的內(nèi)含識(shí)別。因此解析出該事件發(fā)生時(shí)的剪切體形態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)解決此問題就顯得極為重要。

　　RNA剪接示意圖【1】

　　2021年11月25日，海德爾堡大學(xué)的Wojciech P. Galej教授團(tuán)隊(duì)在Science上發(fā)表了題為Structural basis of branch site recognition by the human spliceosome的文章，在該研究中作者分離了人類17S U2 snRNP，并在體外重構(gòu)了其依賴于ATP的重塑和與pre-mRNA 底物的結(jié)合，從而確定了一系列不同構(gòu)象狀態(tài) U2 snRNP的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，包括兩個(gè)以前未知的組裝中間體。這些高分辨率重建提供了對(duì)人類U2 snRNP和前剪接體形成的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)新視角。這些新數(shù)據(jù)指出HTATSF1和SF3B6在促進(jìn)pre-mRNA識(shí)別方面的關(guān)鍵作用。

　　為了純化得到特別代表單一功能狀態(tài)的U2 snRNP子集，作者使用CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯將GFP標(biāo)簽引入HEK293F細(xì)胞的HTATSF1基因組位點(diǎn)，使用抗GFP的納米抗體來分離完整的17S U2 snRNP，其中包含U2 snRNA和22種蛋白質(zhì)，總估計(jì)分子量為1.08 MDa。提高分辨率到2.2 Å后，作者發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)與之前的低分辨率結(jié)構(gòu)是一致的。

　　為了通過冷凍電鏡分析獲得對(duì)BS識(shí)別的機(jī)制，作者用純化的17S U2 snRNP和模型BS寡核苷酸(BPS寡核苷酸)在體外重建了BS識(shí)別。BPS寡核苷酸與U2 snRNA的27-42位互補(bǔ)，并包括一個(gè)凸出的腺苷，用以模擬BP-A。作者通過HTATSF1或DDX46上的GFP標(biāo)簽將17S U2 snRNP固定在抗GFP納米抗體樹脂上，并在各種條件下孵育。在存在ATP和BPS oligo的情況下，U2 snRNP從樹脂中釋放并在通過甘油梯度離心分析時(shí)也能保持與BPS oligo的結(jié)合。在沒有BPS寡核苷酸的情況下，單獨(dú)添加ATP也會(huì)在升高的溫度下誘導(dǎo)HTATSF1解離，這表明這種重構(gòu)可以在功能上與底物結(jié)合分離，從而導(dǎo)致形成重構(gòu)U2 snRNP。

　　后續(xù)的工作作者解析了這兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的U2 snRNP復(fù)合物的高分辨率冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。

　　接下來，作者解析了A樣U2 snRNP的整體結(jié)構(gòu)。盡管A樣U2 snRNP先前的U2 snRNP的低分辨率描述非常一致，但是仍然有跟之前不一致的結(jié)構(gòu)，表明A樣U2 snRNP代表了一個(gè)不同的剪接中間體。改造后的U2 snRNP與A樣U2 snRNP非常相似，除了U2 snRNA 5'端的主要差異以及缺少SF3B6。與17S U2 snRNP類似，這兩種復(fù)合物都可以分為5'-結(jié)構(gòu)域和3'-結(jié)構(gòu)域，都可以很好地獲得結(jié)構(gòu)信息。

　　在這項(xiàng)工作中，17S U2 snRNP的結(jié)構(gòu)表明HTATSF1和BSL以兩種不同的方式相互穩(wěn)定。BSL和HTATSF1LH/UHM之間可以直接發(fā)生相互作用，也可以間接通過U2 snRNA的5'-末端與HTATSF1RRM的可能關(guān)聯(lián)，阻止與BSL競(jìng)爭(zhēng)的RNA結(jié)構(gòu)的形成。本文的數(shù)據(jù)表明，模型BPS寡核苷酸可以與U2 snRNP進(jìn)行堿基配對(duì)相互作用。A樣U2 snRNP的結(jié)構(gòu)捕獲了與分支螺旋相互作用的SF3B6，這提供了兩個(gè)重要信息。首先，除了SLIIa和SF3A2ZnF之外，它還為U2 snRNA提供了一個(gè)特定的結(jié)合位點(diǎn)，這使得分支螺旋結(jié)合口袋內(nèi)的U2 snRNA具備了螺旋幾何形狀。這提供了在缺乏廣泛的互補(bǔ)性的情況下一種穩(wěn)定弱分支點(diǎn)序列的機(jī)制。其次，SF3B6在分支螺旋雙鏈體和U2 snRNA的單鏈區(qū)域的連接處結(jié)合，因此它定義了分支螺旋的長(zhǎng)度和凸起的BP-A相對(duì)于其末端的確切位置。經(jīng)過與BMSL競(jìng)爭(zhēng)的BS序列將繼續(xù)通過最近提出的腳趾固定鏈侵入機(jī)制(toe-hold strand invasion mechanism)逐漸形成分支螺旋。該過程中的中間狀態(tài)(A3'-SSA 復(fù)合物)是通過用剪接抑制素A(SSA)阻斷剪接體組裝而捕獲的，在沒有SSA抑制的情況下，BS序列將繼續(xù)完全形成分支螺旋。此時(shí)將到達(dá)另一個(gè)檢查點(diǎn)：如果存在凸出的BP-A，它將結(jié)合SF3B1中的口袋，這將導(dǎo)致DDX46轉(zhuǎn)變?yōu)榘敕忾]構(gòu)象并解;然而，在沒有正確定位的BP-A的情況下，SF3B1HEAT保持開放構(gòu)象，剪接體停滯。在該復(fù)合物中，Prp5為剪接體組裝的下一步提供位阻，即募集tri-snRNP。Prp5的長(zhǎng)時(shí)間阻塞可能會(huì)啟動(dòng)丟棄途徑。

　　在這項(xiàng)工作中描述的改造形式的U2 snRNP和pre-A復(fù)合物是兩種不同的中間體，它們將次優(yōu)底物引導(dǎo)至丟棄途徑。它們代表BS保真度控制中的不同檢查點(diǎn)，確保穩(wěn)定分支螺旋的形成和正確定位的BP-A的存在。

　　總之，這項(xiàng)工作確定了一系列高分辨率(2.0-2.2 Å)結(jié)構(gòu)，提供了分支位點(diǎn)選擇過程的快照。與底物結(jié)合的U2 snRNP表明SF3B6穩(wěn)定了BS:U2 snRNA復(fù)合體，這有助于結(jié)合序列互補(bǔ)性較差的內(nèi)含子。

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