腸球菌(Enterococcus)是腸道中的一種共生細菌，廣泛分布于自然環境中，包括水、土壤、蔬菜肉類等食物和昆蟲、鳥類、魚類、哺乳動物等野生動物的腸道及糞便中。從20世紀70年代開始，腸球菌感染的發生率和致死率都大大上升。由于這些腸球菌擁有很強的耐藥性并且很容易獲取新的耐藥基因，腸球菌感染往往很危險，現在已成為醫院里最主要的多重耐藥細菌感染源之一。由耐藥性腸球菌而引發心內膜炎、尿路感染和菌血癥而導致的患者死亡率可高達25%以上。

　　細菌蛋白外毒素是很多致病細菌的主要武器。獲得毒素基因往往是“良性”細菌演變成人和動物的主要病原菌的關鍵一步，比如非致病白喉桿菌可以通過噬菌體感染獲得表達白喉毒素的基因從而變成致病菌。腸球菌中以往并沒有發現專門針對人和哺乳動物細胞的蛋白毒素。本研究首次發現和驗證腸球菌獲得了針對人和哺乳動物細胞的蛋白毒素，揭示了腸球菌在毒力和致病機理方面令人擔憂的潛在演化，值得高度警惕。

　　蛋白毒素的發現傳統上是從研究已知疾病和病原菌入手，然后找到致病的毒素。很多人類的致病細菌和病毒都演化于自然界中，傳統研究往往受限于被動等待微生物獲取某種對人致病的能力以及等待臨床診斷上建立起某種疾病和微生物的聯系。這次的重大發現則是起始于從野外采集分離各種腸球菌菌株并進行大規模基因組測序，通過生物信息學分析找到潛在的新毒素基因，然后再通過結構和宿主受體的研究在分子水平上直接闡明毒素的功能和宿主特異性。這項研究充分運用了當前“后基因組時代”對微生物毒力因子和潛在致病機理的研究新途徑，直接揭示了潛在病原菌和致病毒力因子的存在和機理，提供了先發治“菌”的可能性，為防治未來新興病原菌做好準備。

　　這項研究的主要合作者，哈佛醫學院和博德研究所 (Broad Institute)的Michael Gilmore 教授領導的研究組在美國國立衛生研究院資助下，長期從事對腸球菌菌株的采集和基因組測序工作。董民實驗室和Michael Gilmore實驗室合作于2018年在一個采集自美國蒙大拿州野外馬糞中的腸球菌菌株中，找到了編碼新的穿孔毒素的基因。通過進一步的生物信息學分析發現一共有8個類似的毒素(Epx1-8)，構成一個特有的毒素家族。這些毒素目前已經在近年來分離的46種腸球菌菌株中發現(包括分屬于E.faecalis，E. faecium和E.hirae三大類)。這些菌株的來源包括人和動物糞便、超市雞肉、廢水，和人的組織樣品等，其分布地點遍布全球五大洲 。

　　穿孔毒素是細菌的常見毒素類型。被細菌以單體形式分泌出來以后，它們會在宿主細胞膜上聚集并形成跨膜穿孔通道(pore)。穿孔毒素可以破壞宿主上皮屏障、殺死免疫細胞及組織細胞， 因此是很多病原菌的重要致病因子。典型的穿孔毒素比如α型溶血素(α-Hemolysin; Hla)，是金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中重要的致病因子。以α型溶血素為代表的這一類穿孔毒素通常由7個單體聚合形成一個β桶(β-barrel)跨膜穿孔通道，其經典結構早在1996年就通過晶體結構生物學方法解析。為了探究Epx的分子機制，董民實驗室與哈佛醫學院的Jonathan Abraham實驗室和吳皓教授實驗室合作，通過晶體學和冷凍電鏡的方法分別解析了Epx1和Epx4的結構。結果證實Epx1和Epx4屬于β桶穿孔毒素家族(β-barrel pore-forming toxin family)。其整體結構與傳統的α型溶血素家族成員比較像，包含由β-sandwich區域構成的cap結構域、芳香族氨基酸富集的疏水性rim結構域和由β桶形成跨膜穿孔通道stem結構域。有意思的是，與傳統β桶穿孔毒素家族形成的七聚體穿孔通道不同，Epx1和Epx4都形成了八聚的穿孔通道結構。另外一個和已知穿孔毒素不同的地方是Epx1和Epx4都在膜外結構域上方形成了一個額外的β桶結構 (命名為 “Top”結構域)。對Top結構域的幾個關鍵氨基酸殘基的突變研究表明這個結構域對Epx穿孔通道的形成和穩定發揮了重要作用。這些特有的結構特征證實Epx毒素形成β桶穿孔毒素家族中的一個獨特的分支。

　　作者進一步通過細胞實驗揭示了上述馬糞菌株所產生的Epx2是毒性最強的穿孔毒素之一，只需要11-14 ng/mL 就可以殺死一半的HeLa細胞(IC50)。同時，他們發現Epx2表現出了一定的宿主物種選擇性，對人源和猴源細胞的毒性較高，而對狗源和鼠源細胞毒性較低。為了更深入地了解Epx2作用于人源細胞的分子機制，作者通過CRISPR-Cas9介導的全基因組篩選鑒別出了細胞表面的組織相容性復合物 I (major histocompatibility complex I, MHC-I，人源蛋白又稱作人白細胞抗原復合體I ，human leukocyte antigen, HLA-I) 為其特異性受體。另一毒素成員Epx3也利用MHC-I/HLA-I作為受體。這兩種毒素都可以識別人源、馬源、豬源、牛源的MHC-I，而對鼠源的MHC-I識別較弱。這些發現在分子水平上解釋了Epx2和Epx3對宿主的選擇特異性。

　　圖一：文章圖示摘要

　　為了探究這些毒素在腸球菌致病過程中的功能機制，作者把攜帶有Epx2基因的腸球菌株DIV0147和人源的外周血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)以及人源的腸道類器官(human intestinal organoids)進行體外共培養。結果顯示，DIV0147腸球菌對外周血單核細胞以及腸道類器官造成了嚴重損傷。加入針對Epx2的特異抗體則可以完全中和毒性并保護這些細胞。這些發現揭示DIV0147腸球菌通過分泌Epx2來毒殺人源細胞，證實了含有毒素的腸球菌的潛在致病性 (圖一)。

　　作者提到當前研究的主要局限性是尚不知道有何種人或動物的疾病是由這些新發現的毒素和含毒素的菌株所造成的， 這將是未來研究中的重要問題， 也希望這些新型毒素的報道可以推動對其疾病相關性的進一步調查研究。

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